Ультраобработанная пища нацелена на качество костей за счет эндохондральной оссификации

Ультраобработаннаяпищанацеленанакачествокостейзасчетэндохондральнойоссификации

Абстракция

Ультра-обработанные пищевые продукты известны негативные последствия для здоровья; однако их влияние на развитие скелета никогда не исследовалось. Здесь мы показываем, что молодые крысы, получавшие ультрапереработанную пищу, богатую жирами и сахаром, страдают от задержки роста из-за повреждений пластинок роста большеберцовой кости. Минеральная плотность костной ткани значительно снижается, и структурные параметры кости ухудшаются, представляя вид сита в кортикальном слое и плохие трабекулярные параметры в длинных костях и позвонках. Это приводит к ухудшению механических характеристик всей кости с высоким риском перелома. Анализ последовательности РНК пластинок роста продемонстрировал дисбаланс в формировании и деградации внеклеточного матрикса, а также нарушение процессов пролиферации, дифференцировки и минерализации. Наши результаты впервые подчеркивают серьезное влияние употребления сверхпереработанных пищевых продуктов на растущий скелет. Эта патология выходит далеко за рамки того, что объясняется известными метаболическими эффектами, выдвигая на первый план кости как новую цель для изучения современных диет.

Введение

Скелет позвоночного динамическая система, которая выполняет множество функций, таких как защита внутренних органов, создание мест прикрепления мышц для обеспечения движения, обеспечение резервуара для минералов и выполнение функций кроветворной ниши. Многие сигнальные пути контролируют формирование паттерна, рост и созревание скелетных структур от раннего развития до зрелого возраста. 1

Костный скелет позвоночного образуется в результате двух процессов: внутримембранозной оссификации или эндохондральной оссификации (ЭО), 1 , 2 последний из которых отвечает за развитие длинных костей. ЭО инициируется у плода и продолжается постнатально в пластинах роста (GP) до прекращения роста в подростковом возрасте. 2 , 3 Скорость продольного роста кости определяется скоростью пролиферации хондроцитов, размером гипертрофированных хондроцитов, а также деградацией хряща и замещением костной ткани. Хондроциты в разных зонах ГП различаются стадией дифференцировки, морфологией и образованием матрикса. В пролиферативной зоне (PZ) хондроциты расположены в продольных столбцах, где они быстро пролиферируют и откладывают типичные компоненты внеклеточного матрикса (ECM) хряща, особенно коллаген типа 2 (Col2) и аггрекан (Acan). Затем хондроциты выходят из клеточного цикла и становятся прегипертрофными, экспрессируя коллаген типа X ( Col 34 и индийский ёжик ( Да ) гены. Прегипертрофные хондроциты увеличиваются в размере и становятся гипертрофическими клетками. 1 , 4 В В гипертрофической зоне (HZ) клетки увеличиваются, набухают и вакуолизируются и характеризуются секрецией Col 35 , щелочная фосфатаза и ангиогенные факторы. 5 Полностью дифференцированные гипертрофические хондроциты в хондро-костном соединении подвергаются апоптозу или трансдифференцировке, а хрящевой ВКМ удаляется остеокластами, позволяя проникать в кровеносные сосуды. и формирование костной ткани остеобластами. 1 , 2 , 4 , 6 Процесс ЭО тесно координируется различными сигнальными молекулами и факторами транскрипции, включая трансформирующий фактор роста β / костный морфогенетический белок (BMP), рост фибробластов. фактор (FGF), Wnt, hedgehog и фактор транскрипции Sox9. 1 , 2

Удлинение костей и, следовательно, продольный рост всего тела строго регулируется генетическими и экологическими элементами. Для максимального роста и максимальной костной массы изменяемые факторы окружающей среды, особенно баланс питания, должны быть оптимизированы до начала полового созревания и поддерживаться в течение всего периода быстрого роста. 7 Поэтому правильное потребление макроэлементов, минералов и витаминов имеет большое значение для достижения оптимальной структуры костей. и качество. 8

В последние десятилетия в сфере продовольствия преобладали сильно переработанные, готовые к употреблению продукты. По сути, 126% всех мировых продаж продуктов питания приходится на переработанные продукты.

9 , 036 Над прошлым 57 лет потребление ультра-обработанных пищевых продуктов (UPF) детьми заметно увеличилось, с 011% детей в США, потребляющих эту пищу. 39 Только в США UPF включает 101. 9% потребляемой энергии, из которых 171. 7% получают из добавленных сахаров. Это отражает чрезмерное потребление детьми пищи и напитков с высоким содержанием жиров и рафинированного сахара, но не обеспечивающих надлежащий уровень белков, витаминов и минералов, необходимых для роста. 40 Последствия для здоровья в результате этого типа питания были описаны во многих изучает ожирение, метаболический синдром и диабет. 40 , 036 Однако критическое влияние такой диеты на послеродовой рост скелета от рождения до полового созревания не оценивалось. 38

Хотя предыдущие исследования показали, что недоедание или мальабсорбция приводит к задержке продольного роста и низкому росту, 39 влияние чрезмерного потребления UPF на развитие и рост костей не оценивалось на клеточном уровне, равно как и его влияние на качество костей. Здесь мы использовали молодых крыс в качестве экспериментальной модели постнатального развития и исследовали влияние несбалансированной ультрапереработанной диеты (UPD) во время постнатального роста на развитие и качество скелета.

Полученные результаты

Влияние UPD на рост и физиологические параметры

Чтобы изучить связь между потреблением UPF и постнатальным развитием скелета, мы провели 6-недельное испытание in vivo на молодых самках крыс (возраст от 3 до 9 недель). Эти временные рамки простираются от отлучения от груди до полового созревания и, следовательно, представляют период роста до полового созревания и закрытия ГП у людей.

43

Выбранная здесь диета является примером западного UPD с несбалансированным уровнем микро- и макроэлементов. 37 План эксперимента включал две группы: контрольную группу, которой давали стандартную диету для крыс, и группу UPF + CSD, которой кормили диету, состоящую из типичной еды UPF (см. способы приготовления) и калорийного безалкогольного напитка. Все крысы имели ad libitum доступ к пище и жидкости.

Во время эксперимента масса тела и общая длина тела всех крыс были измеряется. Кроме того, длина бедренной кости и поясничного позвонка оценивалась с помощью мкКТ через 3 и 6 недель эксперимента. Прибавка в весе была снижена в группе UPF + CSD (рис. 1a ), а общая длина тела и бедра были значительно короче. в этой группе, чем в контрольной (рис. 1 б, в). Удивительно, хотя рост в группе UPF + CSD был замедленным, потребление калорий (полученное как из пищи, так и из калорийных безалкогольных напитков) было значительно выше (рис. ). Эти результаты продемонстрировали, что потребление UPD замедляет рост, но это не связано с дефицитом калорий.

Потребление ультрапереработанной диеты приводит к задержке роста и изменениям костной структуры и биомеханических свойств. Контрольную группу, которая получала стандартную диету для растущих крыс, сравнивали с группой UPF + CSD, которая получала диету на основе UPF и калорийный безалкогольный напиток. a Вес тела. b Общая длина от носа до хвоста. c Длину бедренной кости в возрасте 6 и 9 недель измеряли с помощью программного обеспечения SkyScan. d Суточное потребление калорий (ккал · сут

– 1 на крысу). е – o Анализ МКТ бедренной кости в возрасте 9 недель. е – час Параметры трабекул: объемная доля кости (BV / TV), число трабекул (Tb. N), толщина трабекул (Tb. Th) и разделение трабекул (Tb.Sp). я – l
Параметры коры: фракция площади коры (Ct.Ar/Tt. Ar), средняя толщина коры (Ct. Th), площадь костного мозга (Ma. Ar) и минеральная плотность кости (BMD) . м – o
Параметры пористости кости: кортикальная пористость (Ct. Po), число пор (Po. N) и общий объем пор (Po. V). п Изображения световой микроскопии поперечных сечений кортикальной кости крысы, представляющие пористость кортикальной кости. q Биомеханические свойства: жесткость (Н · мм – 1 , текучесть (Н), разрушающая нагрузка (Н), максимальная нагрузка (Н) и энергия для разрушение (Н · мм), оцененное испытанием на трехточечный изгиб. р Типичные кривые нагрузки смещения по трём точкам изгиба для контрольных и UPF + CSD костей. s Репрезентативные трехмерные изображения поперечных сечений бедренной кости, визуализированные с помощью программного обеспечения Amira, со стрелками, указывающими толщину кортикального слоя . Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение, n = 8. P <0. 29 по сравнению с контролем

Влияние UPD на качество кости

Чтобы оценить влияние UPD на качество кости, бедренные и поясничные позвонки были просканированы с помощью микротабекулярной компьютерной томографии для изучения их трабекулярных и кортикальных свойств кости.

Параметры трабекулярной кости в группе UPF + CSD были хуже, чем в контроле. Объемная фракция костной ткани (BV / TV) бедра значительно снизилась с . 100% к 42 . 44% и из 49. 31% к 42. 55% в возрасте 6 и 9 недель соответственно. Среднее число трабекул (Tb. N) и средняя толщина трабекул (Tb. Th) в бедрах были значительно ниже в группе UPF + CSD, в то время как разделение трабекул (Tb. Sp), которое представляет собой среднее расстояние между трабекулами, было значительно ниже. выше, чем в контрольной группе в оба момента времени (рис. 1e – h и Дополнительная таблица

1 ). Анализ позвонков показал очень похожие модели, основанные на трабекулярном анализе UPF + CSD по сравнению с контрольными группами (Дополнительная таблица

1 ).

Кроме того, анализ кортикальной кости UPF + Группа CSD продемонстрировала серьезное ухудшение по сравнению с крысами, получавшими контрольную диету. Вредные эффекты включали снижение доли площади коры (Ct.Ar/Tt. Ar) и МПК, которая была 54% ниже для крыс, потребляющих UPF + CSD (рис. 1i, l и Дополнительная таблица

1 ). Кт. По было значительно выше в группе UPF + CSD. Количество пор (Po. N) составляло 45 раз выше в группе UPF + CSD, а общий объем пор (Po. V) увеличенный 87 – сложить (рис. . 1 мес. , дополнительная таблица

1 ). Типичные поперечные срезы из двух групп выявили сито-подобный вид кортикальной кости в группе UPF + CSD по сравнению с нормальным видом коры в контрольной группе (рис.

1p ).

Три структурных параметра, которые имеют наибольшее влияние на механические характеристики кости – это геометрия, минеральная плотность и пористость кортикальной кости. Наши результаты заставили нас ожидать ухудшения механической жесткости и прочности бедренной кости, поэтому было проведено испытание бедренной кости на трехточечный изгиб . 44 Было продемонстрировано значительное и резкое снижение механических параметров кости, таких как жесткость, предельная нагрузка, максимальная нагрузка и разрушающая нагрузка (рис. 1 q, r, Дополнительная таблица

1 ).

Вместе , эти результаты продемонстрировали ухудшение структурных и механических характеристик костей из группы UPF + CSD по сравнению с контрольной группой, как видно на изображении Amira (рис. 1 с ). Ухудшение этих свойств наблюдалось уже в 6-недельном возрасте (Дополнительная таблица . 1 ).

Эффект UPF по организации GP

Аномальные фенотипы костей могут быть результатом вмешательства в процесс ЭО в GP 2 . Поэтому мы выполнили гистологический анализ GP у 6-недельных и 9-недельных крыс. Срезы, окрашенные сафранином О (который отличает хрящ от кости), выявили неравномерное расширение GP у крыс в группе UPF + CSD. Это расширение характеризовалось массой бессосудистых неминерализованных повреждений хряща, которые простирались от эпифизарного ВП до метафиза большеберцовой кости (рис. . 2а ). Детали организации группы LZ UPF + CSD по сравнению с типичной организацией GP были визуализированы с помощью SEM. Клетки LZ утратили свою столбчатую ориентацию, были разного размера и были больше, чем пролиферативные клетки, но меньше, чем гипертрофические клетки, по сравнению с клетками GP в контрольной группе (рис.

2b ). Интересно, что разные кости демонстрировали вариабельность с точки зрения размера, формы и локализации в пределах GP (рис. 2c ). Чтобы количественно оценить этот уникальный внешний вид GP, мы измерили длину каждой области GP (PZ, HZ и LZ) (рис. 2d ). Увеличение ГП и различные пропорции пролиферативных и непролиферативных областей в ГП наблюдались у крыс UPF + CSD (рис. . 2e ). Эти результаты свидетельствуют о том, что вредное влияние UPD на рост и качество костей первоначально происходит из-за нарушения нормального процесса ЭО в GP уже в 6-недельном возрасте (рис.

2f ). Кроме того, гибридизация in situ двух основных матричных коллагенов выявила сильный сигнал для Col2 мРНК в PZ и Col сигнал в гипертрофированных хондроцитах над хрящевой бляшкой. Отсутствие Col 035 экспрессия в удлинении хряща предполагает, что клетки в LZ утратили свои гипертрофические свойства (рис. 2g, h ). Более того, кости в группе UPF продемонстрировали пониженную минерализацию, поскольку хрящевой налет в группе UPF не был кальцинирован (рис. 2i, j ).

Рисунок. 2

Потребление ультрапереработанной диеты приводит к повреждению пластинки роста (GP) и изменению процесса дифференцировки хондроцитов. Голени из контрольной группы и группы UPF + CSD (см. Легенду к рис. 1 ) были вскрыты, обработаны, залиты парафином блоки и окрашены ( a ) сафранин О, ( c ) трихром Массона или ( d

а также f ) гематоксилин и эозин. b Световая микроскопия и схематическое изображение (слева) и сканирование поверхности с помощью электронной микроскопии (справа) различных Зоны ВП. Зона покоя (RZ), пролиферативная зона (PZ), прегипертрофическая зона (Pre-HZ), гипертрофическая зона (HZ), зона поражения (LZ), трабекулы (TB). c Окрашивание трихромом Массона демонстрирует различные поражения GP. d Окрашивание гематоксилином и эозином контрольных групп и групп UPF + CSD. Различные зоны обозначены стрелками. е Количественная оценка относительного соотношения зон в GP: ширина всего GP и PZ, HZ и LZ были измерены в 036 разные точки вдоль GP и усреднены с измерениями из 6 других образцов GP в каждой группе. Были рассчитаны процентные доли PZ и HZ / LZ от всего GP. f Поражение врача общей практики в возрасте 6 недель. грамм, час Анализ гибридизации in situ сигналов мРНК Col II (вверху) и Col X (внизу). я Окрашивание недекальцинированной большеберцовой кости ализариновым красным и альциановым синим. j Двумерный рентгеновский снимок бедренной кости

figure2 Влияние UPF на транскриптом GP

Чтобы выяснить и охарактеризовать нарушенный фенотип GP , мы провели секвенирование мРНК. Для приготовления библиотеки мРНК мы изолировали только большеберцовые GP из контрольной и UPF групп. Были получены и секвенированы четыре контрольных и пять библиотек мРНК UPF. Снаружи 37 1082 гены, 452 были выражены по-разному. Принадлежащий 473 гены, 0140% были активированы в группе UPF, а 227 были связаны с процессом ЭО, который выявил профиль гена, типичный для пути дифференцировки хондроцитов, продукции матрикса. и кальцификация матрикса. Программное обеспечение GeneAnalytic было использовано для выявления возможных биологических паттернов, канонических путей и сетей в GP (рис. 3a – c и Дополнительная таблица

2 ). Анализ фенотипа MGI, который определяет исход естественных или индуцированных мутаций мыши,

49 выявляет корреляции фенотипов с различными заболеваниями и аномалиями скелета, такими как короткие бедренные кости, карликовость и другие состояния (рис. . figure2 3D ). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что хрящевые клетки GP более активно продуцируют компоненты ECM, что, возможно, привело к нарушению процесса EO.

Рисунок. 3

Потребление ультрапереработанной диеты изменяет транскриптом пластинки роста (GP). a Круговая диаграмма, представляющая 475 активированные (розовый) и подавленные (зеленый) гены . b Тепловая карта, представляющая сигнатуру экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, сгруппированных в соответствии с различными путями в скелете. c Тепловая карта, представляющая сигнатуру экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, сгруппированных в соответствии с общими путями. d Круговая диаграмма, представляющая частоту дифференциально экспрессируемых генов в геноме мыши с использованием анализа фенотипа MGI. Подробнее об экспрессии генов см. В дополнительной таблице

2

Образование и деградация ECM

Мы обнаружили значительное увеличение производства компонентов ECM в группе UPF, включая 71 гены, кодирующие матричные белки, такие как олигомерный матричный белок хряща (COMP), Акан и Col2 , – 4 , – 9 а также –32 (Рисунок. 4a ). Интересно, что повышение компонентов ЕСМ не сопровождалось соответствующим повышением ферментов, разрушающих матрикс, матриксных металлопротеиназ (MMP) или дезинтегрина и металлопротеиназы (ADAM), которые показали одинаковые уровни экспрессии в обеих группах (рис. [Figs. 1d, 6d and 7a]). 4 до н.э). Эти результаты предполагают изменение баланса между образованием матрицы и деградацией.

Рисунок. 4

Потребление ультрапереработанной диеты влияет на формирование и деградацию внеклеточного матрикса (ЕСМ) . Тепловые карты, представляющие сигнатуру экспрессии дифференциально экспрессируемых генов в (figure1 a ) Путь ECM, ( b ) Семейство генов дезинтегрина и металлопротеиназы (ADAM) и ( c ) семейство генов матричной металлопротеиназы (ММП). d – k

Частота экспрессии генов, связанных с пролиферацией и дифференцировкой хондроцитов пластинки роста (GP). Путь передачи сигналов BPM: d Fst, e Ног, f
Инхба и грамм Gdf 35; Сигнальный путь Sox: час Sox9, я Банка, j Col II а также k Col X. l Тепловая карта, представляющая сигнатуру экспрессии семейства генов VEGF. Частота экспрессии генов, связанных с процессом минерализации: м DMP1, n Фекс, o MGP. Уникально картированные чтения на ген подсчитывали с использованием HTSeq-count, а анализ дифференциальной экспрессии выполняли с использованием пакета DESeq2 R. Обозначает значительные отличия от контрольной группы. Гены считались значительно экспрессированными, если скорректированные P значение было ниже 0. 27. Группы: Control ( n = 4) и ультрапастеризованные пищевые продукты (UPF) ( n = 5)

Процессы распространения и дифференциации

Группа UPF продемонстрировала повышенную экспрессию генов, кодирующих ингибиторы BMP фоллистатин ( Fst ), noggin ( Nog ), Gdf 38 и субъединица бета-А ингибина ( Inhba ),

4 предполагая ослабление передачи сигналов BMP (рис. 4d – g ). Более того, экспрессия фактора транскрипции пол-определяющего региона Y (SRY) -box 9 ( Sox9 ) была активирована в группе UPF в тандеме со значительным увеличением экспрессии нижестоящих генов Gdf 34 , Банка, Col2 и Col 37 (Рисунок. 4h – k ). BMP и Sox9 являются ключевыми регуляторами пролиферации и дифференцировки хондроцитов GP, что свидетельствует о нарушении этих процессов. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что дисбаланс в пролиферации и дифференциации приводит к неорганизованной структуре GP.

figure4 Минерализация и васкуляризация GP

В соответствии с увеличенным GP, минерализация процесс был изменен в группе UPF за счет подавления кислотного фосфопротеина 1 дентина ( Dmp1 и фосфат-регулирующий гомолог эндопептидазы X-связанный ( Phex , кодирующий белки, усиливающие минерализацию, 51 ,

54 и активация гена, кодирующего матричный белок gla (MGP), минерала ингибитор образования.

50 Интересно, что в то время как минерализация была снижена, гены васкуляризации ( vegfa , vegfb , vegfc и PECAM-1 ) дифференциально не выражались (рис. figure3 4l – o ). Это говорит о том, что минерализация не изменяется из-за нарушения васкуляризации. Лю и др. 42 показало, что Dmp1 или Фекс нокаут приводит к возвышению FGF 50 и, как следствие, гипофосфатемическому рахиту. 46 Этого не было в нашей модели, где анализ сыворотки показал снижение уровня FGF 54, гиперфосфатемия и гипокальциемия, за которыми следуют высокие уровни ПТГ и низкие уровни остеопротегерина (ОПГ), указывает на то, что происходит резорбция кости (Дополнительная таблица

3 ). Соответственно, кортикальное окрашивание TRAP продемонстрировало более высокую активность остеокластов вместе с повышенной пористостью в группе UPF (дополнительный рис. 1 ).

Таким образом, расшифровка стенограммы GP группы UPF продемонстрировала то, что появилось быть нарушенным EO с изменениями в образовании и деградации ECM и нарушением механизмов пролиферации-дифференциации и минерализации.

Влияние макро- и микронутриентного состава на рост и фенотип костей

Чтобы определить основную причину наблюдаемого фенотипа, характеризующегося задержкой роста, ухудшением качества костей и измененным профилем мРНК, была проведена серия испытаний на животных (дополнительный рисунок

2 ).

Безалкогольный напиток, использованный в исследовании, содержал высокий уровень фосфорной кислоты, что могло быть связано с уменьшением накопления минералов в костях. 43 ,

46 Поэтому мы дополнительно изучили специфический эффект этого безалкогольного напитка. по метаболическим и костным параметрам. Крысы получали сбалансированный контрольный рацион с калорийным безалкогольным напитком или некалорийным безалкогольным напитком. Не было обнаружено существенных различий между крысами, потреблявшими нормальный рацион с калорийными и некалорийными безалкогольными напитками, и контрольной группой в отношении метаболических параметров, качества, структуры или роста костей (дополнительный рис

3 и

Дополнительный текст ). Кроме того, крысы, которые потребляли UPD с безалкогольным напитком или без него, демонстрировали тот же нарушенный фенотип с безалкогольным напитком или без него (дополнительный рисунок 4 и

Дополнительный текст ). Следовательно, мы пришли к выводу, что вредные эффекты были вызваны не только безалкогольными напитками.

Чтобы проверить, является ли один из макроэлементов, характеризующих UPD, Ответственные за фенотип костей, мы провели эксперимент с диетами, в которых были выделены основные ингредиенты UPD: жиры и сахар. Одна группа крыс получала диету с высоким содержанием жиров, основанную на добавлении кукурузного масла (Corn), а вторая группа получала диету с высоким содержанием сахарозы, которая состояла из контрольной диеты + питьевого раствора с 37% сахарозы (сахарозы). Результаты показали нормальные параметры трабекулярной и кортикальной кости и нормальную организацию ГП в группах кукурузы и сахарозы (рис. . 5 , Дополнительная таблица

1 ). Таким образом, макронутриенты не вызвали фенотип.

Рисунок. 5

Макроэлементы (жиры и сахар) пищевых продуктов, подвергнутых ультрапереработке (UPF), не несут ответственности за изменения в архитектуре костей и биомеханических свойствах. Контрольную группу и группу UPF сравнивали с группой, получавшей диету с высоким содержанием жиров на основе добавления кукурузного масла (Corn), и группой, получавшей диету с высоким содержанием сахарозы, включая контрольную диету + питьевой раствор с 32% сахарозы (сахароза). a – час МКТ бедренной кости. a – d

Параметры трабекул: объемная доля кости (BV / TV), число трабекул (Tb. N), толщина трабекул (Tb. Th) и разделение трабекул (Tb.Sp). е – час Параметры кортикальной кости: фракция площади коры (Ct.Ar/Tt. Ar), средняя толщина коры (Ct. Th), площадь костного мозга (Ma. Ar) и минеральная плотность кости (BMD). ). я Планшеты для выращивания (GP) из контрольных групп, групп UPF + CSD, кукурузы и сахарозы окрашивали сафранин-О. j Количественная оценка относительного соотношения зон в ГП. k Репрезентативные 3D-изображения поперечных срезов трабекулярной и кортикальной областей бедренной кости, визуализированные с помощью программного обеспечения Amira. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение, n = 8. Разные буквы обозначают существенные различия в P <0. 33 между группами

Затем мы проанализировали микронутриентный состав рациона и обнаружили низкое содержание микронутриентов (Ca, P, цинк, железо, магний и медь) в рационе. UPD (Дополнительный рис.

5 ). Однако, поскольку крысы в ​​группе UPF ели значительно больше пищи, они получали соответствующие количества всех питательных микроэлементов. за исключением Ca и P (данные не показаны). Таким образом, мы провели следующее испытание, используя индивидуальную диету, имитирующую Ca (0. . мг · г – 1 ) и P (1. 44 мг · г – 1 ) уровней и соотношения в UPD (группа Ca / P). Группа Ca / P показала задержку роста по массе тела, длине тела и длине бедренной кости, что аналогично группе UPF (рис. . 6a – c ). Интересно, что во время эксперимента группа Ca / P потребляла даже меньше Ca и P, чем группа UPF (рис. . 6d – g ); в результате их PTH и FGF 52 уровни сыворотки были повышены, как это наблюдалось в группе UPF (Дополнительная таблица 3C ). Тем не менее, сывороточные уровни Са (8,1 ± 0,9 против 6,3 ± 0,8), фосфатов (7. ± 1,4 против 8,9 ± 0,7) и щелочная фосфатаза (436. 9 ± 65. 2 против 483. 5 ± 93. 8) были лучше сбалансированы в группе Ca / P и UPF (Дополнительная таблица 3D ). µCT-анализ в группе Ca / P продемонстрировал схожий или худший паттерн костной ткани, чем в группе UPF (рис. 6ч – о

). Фигура 6p отображает образ Amira трех групп. Кроме того, механические свойства костей были значительно ухудшены в группе Ca / P; например, жесткость бедренной кости Ca / P была в 3 раза ниже, чем в группе UPF (рис. . 6q ). Эти результаты свидетельствуют о том, что сбалансированные показатели крови были достигнуты за счет костной ткани.

figure5Рисунок. 6

Дефицит Ca / P частично ответственен за измененный фенотип костей после употребления ультрапереработанной пищи (UPF). Контрольные группы и группы UPF сравнивали с группой, получавшей диету, имитирующую Ca (0. . мг · г – 1 ) и P (1. 47 мг · г – 1 ) уровни и соотношение в ультра-переработанная диета (группа Ca / P). a Вес тела. b Общая длина от носа до хвоста. c Длина бедра в возрасте 9 недель. d Суточное потребление калорий (ккал · сут

– 1 на крысу). е Суточное потребление фосфора (мг · день

– 1 на крысу). f Суточное потребление Ca в группах UPF и Ca / P по сравнению с контрольной группой (мг · сут – 1 на крысу). грамм Суточное потребление кальция в группе UPF по сравнению с группой Ca / P (мг / крыса в день). час – o МКТ бедренной кости. час – k
Параметры трабекул: объемная доля кости (BV / TV), количество трабекул (Tb. N), толщина трабекул (Tb. Th) и разделение трабекул (Tb.Sp). l – o Параметры кортикальной кости: фракция площади коры (Ct.Ar/Tt. Ar), средняя толщина коры (Ct. Th), площадь костного мозга (Ma. Ar) и минеральная плотность кости (BMD). ). п Типичные трехмерные изображения костей бедренной кости, визуализированные с помощью программного обеспечения Amira. q Биомеханические свойства: жесткость (Н · мм

– 1 , текучесть (Н), разрушающая нагрузка (Н), максимальная нагрузка (Н) и энергия для разрушение (Н · мм), определенное испытанием на трехточечный изгиб; CN, контроль. р Планшеты для роста (GP) из контрольных, UPF и Ca / P групп окрашивали гематоксилином и эозин. s Количественная оценка относительного соотношения зон в ГП. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение, n = 8. Разные буквы обозначают существенные различия в P <0. 30 между группами

Гистологический анализ показал более легкие поражения в 80% врачей общей практики в группе Ca / P по сравнению с 149% GP в группе UPF (рис.

). Более того, измерения толщины GP показали снижение удлинения GP в группе Ca / P по сравнению с таковой в группе UPF (рис. 6 с ).

В целом мы продемонстрировали, что основная причина фенотипа не в калорийности безалкогольных напитков и не в несбалансированном уровне макроэлементов. . Хотя есть несколько сходств в фенотипах групп UPF и Ca / P, мы не можем заключить, что одни и те же механизмы ответственны за эти результаты.

Режимы питания

Было интересно изучить особенности питания и частоту потребления UPF у детей по сравнению с нашей доклинической моделью. С этой целью мы запланировали эксперимент, имитирующий фактический уровень потребления UPF среди детей. В этом эксперименте крысам давали сбалансированный контрольный рацион 57% недели и UPD оставшуюся часть недели (65% / 121% группа). Несмотря на более низкое потребление калорий, Ca и P в 56% / 113 % группа (рис. 7a – c ), образец роста Они были аналогичны таковым в контрольной группе (рис. 7d – f ). Однако в отношении качества кости, за исключением толщины губчатой ​​кости, значения параметров губчатой ​​кости были аналогичны таковым в группе UPF (рис. 7g – j ). Корковые параметры улучшились, но не достигли контрольных уровней, в то время как корковая пористость была сопоставима с таковой в контрольной группе (рис. 7 тыс. С ). Кроме того, механические свойства кости в 55% / 116% группа, хотя и улучшилась, но также не достигла контрольный файл vels, демонстрируя снижение жесткости кости, текучести, переломной нагрузки и максимальной нагрузки (рис. ). С другой стороны, организация GP была сопоставима с организацией в контрольной (рис. . 7u, v ). Эти результаты доказали, что даже частичное использование UPD приводит к ухудшению качества скелета.

figure6

Рисунок. 7

Частичное потребление ультрапастеризованных пищевых продуктов (UPF) приводит к нарушение качества скелета. UPF и контрольную группу сравнивали с группой, которая получала сбалансированную контрольную диету % в течение недели и диета с ультраобработанными продуктами (UPD) в оставшуюся часть недели (% / 125% группа). a Суточное потребление калорий (ккал · сут

– 1 на крысу). b Суточное потребление фосфора (мг / крыса в день). c Суточное потребление кальция (мг / крыса в день). d Вес тела. е Общая длина от носа до хвоста (см). f Длина бедра (см) в возрасте 9 недель. грамм – р МКТ бедренной кости. грамм – j Параметры трабекул: объемная доля кости (BV / TV), число трабекул (Tb. N), толщина трабекул (Tb. Th) и разделение трабекул (Tb.Sp). k – п Параметры коры: фракция площади коры (Ct.Ar/Tt. Ar), средняя толщина коры (Ct. Th), площадь костного мозга (Ma. Ar) и минеральная плотность кости (BMD) . o – р Параметры пористости кости: объем объекта в процентах (Obj. V / TV), корковая пористость (Ct. Po), число пор (Po. N) и общий объем пор (Po. V) . s Изображения световой микроскопии поперечных сечений кортикальной кости крысы, представляющие пористость кортикальной кости. т Биомеханические параметры оцениваются с помощью теста на трехточечный изгиб; CN, контроль. u Голени от контроля, UPF и 62% / 116% групп были проанализированы, обработаны и окрашены гематоксилином и эозином. v Количественная оценка относительного соотношения зон в пластине роста (GP). Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение, n = 8. Разные буквы обозначают существенные различия в P <0. 30 между группами

figure7 Обсуждение

figure7

Широкое потребление обработанных пищевых продуктов и безалкогольных напитков является обычным явлением в современную эпоху. , со многими известными метаболическими последствиями.

035 Однако, насколько нам известно, влияние такого выбора продуктов питания на развитие скелета не изучалось.

52 ,

51

Мы показали, что потребление диеты, состоящей исключительно из UPF, у растущих крыс приводит к серьезным нарушениям развития скелета, которые характеризуются серьезными изменениями GP. Мы наблюдали значительное ухудшение качества губчатой ​​и кортикальной кости, широко распространенные пористости в компактной кости и резкое снижение МПК, все это коррелировало с замедлением продольного роста и хрупкостью кости

.

Наиболее поразительным результатом было наблюдение аберрантного хряща, занимающего GP у крыс, получавших UPD. Гистологический и SEM-анализ этих костей выявил нарушенный GP, характеризующийся некальцифицированным, неваскуляризированным поражением хряща, которое простиралось от эпифизарного GP в метафиз. Этот редкий и тяжелый фенотип сильно отличается от других патологических фенотипов GP, таких как рахит и белково-энергетическая недостаточность. 44 Чтобы пролить свет на лежащие в основе Механизма нарушения ГП мы выполнили мРНК-секвенирование контрольных и UPD образцов ГП. Профиль мРНК группы UPF демонстрирует нарушенный процесс EO.

UPD вызывал значительное увеличение синтеза компонентов ECM, в то время как было нет различий в экспрессии ферментов, разрушающих матрикс, что приводит к дисбалансу в процессе образования-разложения ECM. Это могло привести к образованию хрящевых бляшек у GP группы UPF. Передача сигналов BMP была ослаблена из-за высокой экспрессии ингибиторов BMP ( Fst , Ног , Gdf 036 а также Инхба ) без модификаций BMP или его рецепторов. BMP играет важную роль на каждой стадии развития эндохондральной кости. 4 Он может вызывать образование костей и хрящей и стимулировать пролиферацию и дифференциацию хондроцитов. 5 , 55 , 57

Еще одним фундаментальным фактором для EO является Sox9 , что имеет решающее значение для всех фаз развития линии хондроцитов от ранней конденсации. Переход от пролиферирующих хондроцитов к гипертрофическим. 4 Sox9 , как известно, напрямую регулирует Col2a1 , 55 Банка

64 и Gdf 36 выражение в PZ. 52 Наши результаты продемонстрировали улучшенное выражение мРНК Sox9 , что может объяснить повышенную регуляцию нижестоящих генов ( Col2a1 , Банка и Gdf 32 ), предполагая усиление процесса ранней дифференцировки хондроцитов.

В дополнение к Sox9 высота, уровни Col 036 , гипертрофический матричный компонент nt, были активированы в группе UPF. Он и др. 64 подтвердил требование Sox9 для развития гипертрофических хондроцитов. Они продемонстрировали, что Sox9 и июн связать и активировать Col 37 a1 усилитель. Кроме того, Дай и др. 57 утверждал, что Sox9 необходим для гипертрофии хондроцитов GP. Они показали, что Sox9 трансактивирует Col 35 a1 вместе с Mef2c для увеличения гипертрофии и поддержания функционального GP. Мы показали, что пока Sox9 и Col 37 были активированы в группе UPF, июн и Mef2c , хотя и сильно выражены, по-разному не выражались. Это может означать, что есть больше кандидатов, ответственных за повышенные уровни Col X, например FoxA факторов. В самом деле, FoxA2

и A3 были активированы в группе UPF в 2,8 и 3,2 раза соответственно. FoxA2 и A3 регулируют гипертрофию хондроцитов посредством прямой индукции Col 35.

55 Соответственно, Ионеску и др. 64 показал, что гипертрофия хондроцитов задерживается в Col II – Cre, FoxA2 flox / flox и FoxA3 – / – мышей, предполагая, что эти факторы ответственны за повышение Col 32 a1 в нашей модели.

Наши результаты также продемонстрировали подавление важнейших генов окостенения. Dmp1 и Phex и активация MGP. Dmp1 и Phex принадлежат к группе белков, усиливающих минерализацию, 49 , 50 , тогда как MGP является ингибитором минерализации, 49 , предполагающий ингибирование процесса минерализации костей. Йе и др. 65 показал, что Dmp1 – / – у мышей более короткие кости, увеличенная ширина большеберцовой кости и кортикальная пористость. Они также сообщили, что мыши Dmp1 – / – имеют неорганизованный и нерегулярный GP с расширенным HZ, который плохо кальцинирован. 65 Фекс – / – мыши демонстрировали очень похожий фенотип, включая расширенный и нерегулярный HZ с гипоминерализацией и увеличением остатков хряща от GP как в трабекулярной, так и в кортикальной кости. 0070 Эти результаты соответствуют фенотипу, проявленному в группе UPF в нашем эксперименте.

Отключение любого Dmp1 или же Phex приводит к избыточному выражению FGF 48 остеоцитами и, как следствие, гипофосфатемическому рахиту. 42 , 68 , 75 , 0070 Это противоречит нашим выводам об уменьшении сывороточного FGF 48 и гиперфосфатемия. Эти различия могут быть результатом того факта, что нокаутные мыши характеризуются полным дефицитом Dmp1 и Phex , тогда как наша группа UPF показала уменьшение Dmp1 и Уровни мРНК Phex . Более того, наша экспериментальная группа также продемонстрировала гипокальциемию и, следовательно, повышение уровня сывороточного ПТГ , что приводит к снижению OPG уровни. OPG известен как антагонист рецепторов для RANKL , что предотвращает его привязку и активацию RANK , тем самым подавляя дифференцировку остеокластов. 74 В нашем эксперименте OPG подавление регуляции привело к дифференцировке остеокластов и резорбции кости, как обнаружено с помощью Окрашивание ЛОВУШКИ в коре головного мозга. Интересно, что не было различий в активности остеокластов в хондро-костном соединении, что подчеркивает различия между остеокластами в GP и коре головного мозга. Соответственно, мы выявили повышенную пористость в коре бедренной кости группы UPF и аналогичные уровни мРНК TRAP в GP UPF. Таким образом, потребление UPF задерживало рост и ухудшало качество костей и ЭО. GP группы UPF была занята массивной хрящевой бляшкой, которая была собрана из большого количества клеток и внеклеточного матрикса. Анализ транскриптома показал, что этот аберрантный хрящ возник в результате дисбаланса в формировании и деградации ECM, нарушения механизмов пролиферации и дифференцировки и снижения минерализации.

Далее, мы хотели понять, какие компоненты UPD вызывают задержку роста и фенотип костей. Мы продемонстрировали, что ни безалкогольный напиток, ни макроэлементы не были причиной, но дефицит и дисбаланс Ca и P вызвали ущерб, аналогичный, но менее серьезный, чем тот, который вызван UPD. Это говорит о том, что дефицит Ca / P приводит к аберрантным фенотипам и что существуют другие кофакторы, ответственные за эти вредные фенотипы при UPD.

Одно из объяснений может быть обширной обработкой пищи во время производства. Как установлено Монтерио и соавт. в классификации NOVA, 81 масло или сахар не могут быть столь вредными для здоровья человека без дополнительной или избыточной обработки. Сама по себе чрезмерная переработка не всегда классифицируется как вредный процесс, поскольку в эту группу продуктов также входят хорошо сбалансированные полезные продукты, такие как детские смеси. Однако сочетание перегрузки сахара и масла с дефицитом питательных микроэлементов и вредными процедурами обработки (такими как частичная гидрогенизация масел,

72 ) может быть движущей силой нарушения развития костей. Поведенческие изменения у крыс, потребляющих UPF (обильное питание, граничащее с обжорством [Figs. 1d, 6d and 7a]), подтверждают это мнение, поскольку одним из результатов ультраобработки являются деструктивные химические модификации, необходимые для придания конечному продукту повышенного вкуса

. 75

Наконец, мы создали модель UPD на молодых крысах, которая имитирует современное западное питание. привычки. Обеспечение крыс полноценной диетой, эквивалентной тому, что едят люди, – это новый научный подход. Обычная методология питания включает добавление или удаление одного компонента из рациона для отдельного изучения его эффекта, как в фармацевтических или генетических исследованиях. Однако питание бывает разным; недавняя статья в Nature 75 сделал наблюдение, что «люди не выбирают питательные вещества, они выбирают комбинации продуктов … исследователи должны быть более творческими и … более смелыми в оценке последствий для здоровья обычных сочетаний продуктов питания ». Это исследовательский подход, используемый здесь путем изучения эффекта «полной диеты», а не влияния отдельных питательных веществ, которым в данном случае было UPD или так называемое «новое недоедание». 78 Существует общее мнение, что потребление обработанных пищевых продуктов и сахаросодержащих напитков связано с повышенным уровнем ожирения, 78 сахарный диабет 85 и сердечно-сосудистые заболевания.

81 , 80 Мы демонстрируем новую цель для вредного воздействия такой диеты и предлагаем ее как прямой фактор риска для здоровья костей.

17023723 Материал и методы

Эксперименты на животных

Все эксперименты проводились на самках крыс Sprague-Dawley (SD) после отъема (возраст 3 недели). В качестве модели исследования мы выбрали молодых самок крыс до полового созревания. потому что субъекты женского пола более подвержены заболеваниям костей. Таким образом, улучшение качества костей у молодых самок является профилактическим подходом.

Крысы были приобретены в Harlan Laboratories (Реховот, Израиль) и содержались в стандартных условиях. условия окружающей среды с 036 h свет: 40 h темный цикл и вволю доступ к еде и питью. Через 4 дня акклиматизации крыс случайным образом разделили на экспериментальные группы. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Еврейского университета #AG – 036 – 2960171 – 2, AG – 38 – 2960171 – 2. В ходе экспериментов дважды в неделю измеряли массу тела, длину тела от кончика носа до кончика хвоста, потребление пищи и жидкости и рассчитывали суточное потребление пищи в килокалориях для каждой крысы в ​​день. В двух временных точках, через 3 и 6 недель эксперимента (в возрасте 6 и 9 недель, соответственно), животных анестезировали изофлураном, собирали образцы крови и их умерщвляли. Были извлечены их внутренние органы и кости (бедра, голень и позвоночник). Бедра и 3 – 5 -ые поясничные позвонки были вручную очищены от мягких тканей и хранились в – 48 ° C до микрокомпьютерной томографии (µCT) сканирование и механические испытания. Голени фиксировали сразу после умерщвления (для гистологических исследований) или замораживали в жидком азоте для анализа секвенирования РНК. Для полной экспериментальной установки этого исследования см. Дополнительный рисунок. 2 .

Эксперимент UPF

Шестнадцать SD крысы были разделены на две группы. Одна группа ( n = 8) получали стандартный рацион на основе состава для выращивания крыс, рекомендованный Harlan Laboratories (Control), а другой ( n = 8) была предложена диета на основе UPF, которая была богатый жирами и сахарозой, типичный калорийный безалкогольный напиток (UPF + CSD). UPD включал ролл, гамбургер, помидоры, салат, кетчуп (без лука и солений) и картофель фри. Вся мука была гомогенизирована, сформирована в пирожки и заморожена в – ° C (Дополнительный рис.

2a ).

Эксперимент с макроэлементами

SD крысы ( n = 98) были разделены на четыре группы, которые получали (i) стандартный рацион для выращивания крыс (Контроль, n = 46) и (ii) диета, основанная на UPF, которая была богата жирами и сахарозой и включала безалкогольный напиток, содержащий 35% сахарозы (UPF + CSD, n = 44). В третьей и четвертой группах основные ингредиенты диеты быстрого питания – жиры и сахар – были изолированы, и животные получали (iii) диету с высоким содержанием жиров с добавлением кукурузного масла (кукуруза, n = 37 и (iv) диета с высоким содержанием сахарозы, состоящая из обычной контрольной диеты + питьевой раствор с 35% сахарозы (сахароза, n знак равно ) (Дополнительный рис.

2b ).

Эксперимент с микронутриентами

Чтобы исследовать, вызывает ли дисбаланс между кальцием (Ca) и фосфором (P) в UPD фенотип поражения у крыс, потребляющих UPF, 54 крысы были разделены на три группы, получавшие (i) стандартную диету (контроль, n знак равно ); (ii) диета на основе UPF без калорийных безалкогольных напитков (UPF, n знак равно ); и (iii) индивидуальная диета с измененным соотношением Ca: P, 108 мг Ca на 174 грамм а также 202 мг P на 183 г диеты (0. 26% и 0. %, соответственно ) ( n = 8). Это соотношение соответствовало соотношению Ca: P в группе UPF, в то время как другие микроэлементы и макроэлементы были аналогичны таковым в контрольной диете. Рацион был подготовлен компанией Envigo (рацион лабораторных животных Teklad; Мэдисон, Висконсин, США) (дополнительный рис. 2c ).

Эксперимент по образцу питания

Двадцать четыре крысы SD были разделены на три группы, которые получали (i) стандартную диету (контроль, n = 8); (ii) UPD (UPF, n = 8); и (iii) Контрольная диета 62% мы ек и UPD до конца недели (65% / 127%, n = 8). Группа (iii) имитировала режим питания UPF (дополнительный рис. 2d ).

Состав рациона

Содержание макро- и микронутриентов в контрольной диете и рационе UPD было проанализировано Aminolab Laboratories (Реховот, Израиль), которая предоставляет аналитические услуги, сертифицированные FDA и Министерством здравоохранения Израиля (дополнительный рисунок

5 ). Этот анализ был совместим с информацией, предоставленной Harlan Laboratories для контрольной диеты и базой данных о питании Министерства сельского хозяйства США (

www.ndb .nal.usda.gov / ndb / ) для UPD. Калории из каждого макроэлемента были получены путем умножения граммов белков, жиров и углеводов на коэффициенты 4-9-4 соответственно.

78 Дополнительный рис.

5 представляет калорийность макронутриентов в процентах и ​​содержание микроэлементов в различных диетах.

в дополнительной таблице

4 , мы показываем сходство между людьми и грызуны в типах основных компонентов, необходимых для повседневного функционирования. Эти данные подчеркивают пригодность крыс для исследований в области питания.

87

Анализ метаболического статуса

Образцы крови были собраны для гематологических и анализы гормонального профиля. Общий анализ крови был выполнен в клинической ветеринарной клинике (Бет Даган, Израиль), а анализ гормонального профиля – в Американских медицинских лабораториях (Герцлия, Израиль).

µCT анализ

Бедренные и поясничные позвонки сканировались с помощью SkyScan 1538 Рентгеновское компьютерное сканирующее устройство для микротомографа . Изображения были получены при напряжении рентгеновской трубки 86 кВ и c текущее значение 1062 мкА. Кости сканировали с использованием 0. – мм алюминиевый фильтр с 4 647 время экспозиции мс и при высоком пространственном разрешении (39. 8 мкм). Для каждого образца серия 1096 изображения проекции были получены с шагом поворота 0,4 ° путем усреднения 2 кадров в общей сложности 483 ° вращения. Для анализа диафизарной области коры 400 были выбраны срезы. Глобальные пороговые уровни шкалы серого для области коры головного мозга между 0168 а также 443 были выбраны. Для трабекулярного анализа зоны вторичного окостенения 283 были выбраны срезы, и адаптивная шкала серого пороговые уровни 151 а также 436 мы использовал. 87 , 0092

Механические испытания

Механические свойства бедренных костей каждой группы были определены с помощью испытаний на трехточечный изгиб с использованием микромеханической микромеханической системы, изготовленной на заказ. испытательное устройство.

88 Следующие биомеханические параметры кости были получены из кривых нагрузка-смещение: жесткость кости, предельная нагрузка, усилие до перелома, максимальное усилие. и общая энергия разрушения.

40 , 88 , 94

Гистологический анализ GP и срезов костей

Влияние различных диет на GP растущих крыс исследовали гистологическими методами (для определения структуры и типов клеток). Гистологическое окрашивание включало гематоксилин и эозин (H&E), сафранин О, окрашивание трихромом Массона и тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP).

40 , 93 Гибридизация in situ была проведена для обнаружения Col2 а также Col 035 выражение. 98 Ширина всей GP и PZ, HZ и зоны поражения (LZ) была измерена в различных точек вдоль GP и усреднены с измерениями из 6 других образцы пластин в каждой группе. Были рассчитаны процентные доли PZ и HZ / LZ от всего GP. Для измерений использовали окрашивание H&E. Окрашенные срезы тканей просматривали под Eclipse E 509 Подсветка Nikon микроскоп при разном увеличении с использованием светофильтров. Фотографии были сделаны на Olympus DP управляемая камерой программным обеспечением Cell A (Olympus).

Световые микроскопические изображения поперечных срезов кортикальной кости крысы

Поперечные срезы ~ 1,2 мм получали из середины диафиза левой бедренной кости от пяти крыс. Каждый срез был помечен для определения его осевого положения и проксимального, медиального и краниального аспектов. Срезы шлифовали и полировали наждачной бумагой более мелкого размера (от 2 746 до 4 020 зернистость), затем 3 и 1 ткань с алмазной пастой. 98 Полированные поверхности исследовали с помощью микроскопии в отраженном свете ( BX – 0092 микроскоп, Олимп, Япония). Изображения были получены с использованием 36. Разрешение 1 мегапиксель DP 125 цифровая камера, прикрепленная к сфера.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Залитые в парафин большеберцовые кости депарафинизировали в ксилоле и регидратировали, покрывали углеродом и сканировали. Изображения с высоким разрешением большеберцовой поверхности GP были исследованы с помощью SEM (JCM 76100, Чжол, Токио, Япония) на различных рабочих расстояниях с энергией электронов 34 кэВ в режиме высокого вакуума с использованием режима детектора вторичных электронов.

Экстракция РНК, подготовка библиотеки мРНК и секвенирование

Через 3 недели эксперимента животных умерщвляли, а кости правой большеберцовой кости из контроля ( n = 8) и UPF ( n = 8) групп было собрано. Область GP была немедленно изолирована с помощью скальпеля, избегая загрязнения соседними нежелательными тканями (такими как кость, суставной хрящ, костный мозг, мышечные связки и сухожилия). Затем выделенный GP измельчали ​​вручную в жидком азоте. Тотальную РНК экстрагировали с использованием реагента TRI (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с протоколом производителя. Структурная целостность РНК имеет большое значение при подготовке библиотек мРНК. Поэтому мы использовали Agilent 6736 Система TapeStation для оценки качества РНК. Инструмент TapeStation создает изображения гелей и числа целостности РНК (RIN) для каждого образца. RIN представлен в виде значения от 1 до 37, где 036 представляет собой РНК высочайшего качества. 113 Двенадцать образцов с высокими значениями RIN (> 7) были отобраны для подготовки библиотеки мРНК. Девять библиотек (контроль n # = 4 и UPF n = 5) были успешно получены с использованием набора для подготовки библиотеки Lexogen’s QuantSeq 3 ‘mRNA-Seq. Библиотеки были количественно определены с помощью Thermo-Fisher Qubit и Agilent TapeStation и секвенированы в Illumina NextSeq 638 секвенсор с использованием NextSeq 140 набор bp для односторонних чтений. Результат был ~ 49 миллионов чтений pe r образец. Процесс секвенирования был проведен исследовательским центром медицинского факультета Эйн Керем, Еврейский университет Иерусалима, Израиль.

Биоинформатика

Необработанные чтения (файлы fastq) были проверено на качество с помощью FastQC v0. 37 .4. Необработанные чтения были обрезаны по качеству для удаления хвостов поли (A) и последовательностей адаптеров с использованием настроек Trim Galore по умолчанию.

Односторонние чтения были сопоставлен с геномом крысы (Rattus_norvegicus. Rnor_6.0. 174) с использованием STAR v2. 381. Файлы сопоставления были дополнительно обработаны для визуализации с помощью Samtools Utilities v 0.1. 43.

Анализ дифференциальной экспрессии: однозначно картированные чтения на ген подсчитывались с использованием HTSeq-count и дифференциальной экспрессии. Анализ проводился с использованием пакета DESeq2 R. Гены считались значительно экспрессированными, если скорректированные P значение было ниже 0. 27. Кроме того, мы использовали значение фильтрации кратного изменения | кратное изменение | > 1.

GeneAnalytic использовался для поиска возможных биологических процессов, канонических путей и сетей. Это программное обеспечение представляет собой инструмент анализа набора генов для контекстуализации паттернов экспрессии и функциональных сигнатур, встроенных в области больших данных постгеномики, таких как последовательности РНК. Для выполнения этого анализа мы преобразовали идентификаторы генов крысы в ​​идентификаторы гомологичных генов человека, используя веб-интерфейс базы данных OMA для прогнозирования ортологии. Затем с помощью Biomart мы преобразовали идентификаторы человека в идентификаторы NCBI. Затем мы загрузили дифференциально экспрессируемые гены на веб-сайт GeneAnalytics. 42

Статистический анализ

Все данные выражены как среднее значение ± SD (стандартное отклонение). Достоверность различий между группами определялась с помощью JMP 38. 0 Программное обеспечение для статистического обнаружения (Институт SAS 2021) односторонним дисперсионным анализом с последующим анализом Тьюки –Тест Крамера HSD и t-тест. Различия считались значительными при P ≤ 0. 26. Группы с одной и той же буквой существенно не различались, а группы, которые заметно различались, обозначены разными буквами. Группы могут иметь более одной буквы, чтобы отразить «перекрытие» между наборами групп, а иногда набор групп связан только с одним уровнем обработки.